人胚胎生殖细胞体外培养条件的优化及细胞移植实验方法

1.1   主要试剂   DMEM培养基 （GIBCO/BRL 、高糖）、胎牛血清（fetal calf serum , FCS , Hyclone）、碱性成纤维细胞生长因子（bFGF , R&D公司）、白血病抑制因子（LIF，R&D公司）、培养液A：DMEM液（高糖）+15%胎牛血清+0.1 mol/Lβ-巯基乙醇+2 mmol/L谷氨酰胺+100 U/ml青霉素+100 U/L 链霉素、培养液B：DMEM液（高糖）+15%胎牛血清+0.1 mol/Lβ-巯基乙醇+2 mmol/L 谷氨酰胺+100 U/ml青霉素+100 U/L 链霉素 +1000 U/ml hLIF +1 ng/ml bFGF[30]、胰蛋白酶（Sigma）及EDTA、MAB-1281（小鼠抗人细胞核单克隆抗体，CHEMICHON）、正常山羊血清 （博士德公司）、EnVision检测试剂盒（GK500705，Gene Tech, 盒中包括通用型二抗，DAB及稀释液）。

    1.2   胚胎来源   收集苏州大学附属第二 医院 妇产科，苏州市妇幼保健中心人工中止妊娠的5~10周人胚，每例胚胎均经孕妇和道义委员会同意，胚胎需完整，无严重污染。

    1.3   人EG细胞的原代培养   取5~10周流产胚胎，在流产后6 h内，于超净工作台内，用含双抗（400 U/ml青霉素、400 U/ml链霉素）的无Ca2+、Mg2+的PBS冲洗胚胎，将胚胎移入无菌培养皿，打开胚体体腔，去除内脏，将背侧肠系膜及两边的生殖嵴从胚体背侧撕下，用含高浓度双抗的无菌PBS冲洗组织块数次，将取出的组织切成1 mm3左右的小块。将切碎的组织块移入4个培养瓶内，两瓶滴加少量培养液A， 两瓶滴加少量培养液B。于37 ℃、5%CO2条件下培养，24 h后加入足量培养液。以后每2天半量换液，每日于倒置显微镜下观察细胞生长状态。

    1.4   人EG细胞的传代培养   挑选细胞已铺满瓶底的培养瓶，弃去瓶内培养液，用0.25%胰蛋白酶-0.02%EDTA溶液1~2 ml消化细胞，2~4 min后，镜下观察，当人EG细胞集落开始分散形成由数个细胞组成的细胞团时，加入3 ml与原培养液相同的A或B培养液终止消化。用吹管将细胞吹打成单细胞悬液，吸出一半移入另一个培养瓶，于37 ℃、5% CO2条件下培养，次日换液。追踪观察传代细胞的生长状况。

    1.5   移植细胞的制备   移植前1 h，以无菌接种针挑取传代培养至第4代人EG细胞集落，0.25%胰蛋白酶-0.02%EDTA消化[3]，待细胞发生胞质回缩，细胞集落分散开时，即加含血清培养基终止消化，用吸管反复轻轻吹打瓶底，使细胞成为均匀的单细胞悬液，用无菌PBS离心洗涤2次，将细胞吹打均匀，计数板计数，调密度至1×106／ml。以微量注射器吸取50 μl，置4 ℃待用。

    1.6   实验动物分组及心肌梗死模型制作   将体重200~250 g SD大鼠40只随机分为2组：（1）急性心肌梗死+人EG细胞（AMI+hEGcs, n=28）;大鼠心肌梗死后在梗死区边缘分四点注射各点注入12 μl细胞悬液；（2）急性心肌梗死对照组（AMI+PBS，n=12）：大鼠心肌梗死后在梗死区边缘分4点注射各点注入12 μl PBS。具体步骤参照 文献 [4]。建模成功后即在心肌梗死区边缘用微量注射器分4点注射，各点注入12 μl人EG细胞悬液，密度为1×106／ml，对照组以同样方法注入等量的无菌PBS。关胸，维持辅助呼吸至自主呼吸恢复，送回笼中饲养。术后肌肉注射青霉索40 U以预防感染，并在30 ℃条件下苏醒。全手术过程为无菌操作，术后不需拆线。

    1.7   免疫组织化学法鉴定   移植后1 d、1、2、4周，分别取7只移植组和3只对照组大鼠，用4%水合氯醛腹腔注射麻醉，取出心，PBS冲洗血液，去除左右心房和右心室，将左心室部位用4%多聚甲醛固定，石蜡包埋，连续切片，石蜡切片采用二步法进行免疫组织化学标记，一抗分别为鼠抗人细胞核单抗（1∶100，MAB1281），二抗为通用型二抗，显微镜下观察。实验严格按照说明书进行操作。